β-甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质探讨

时间：2021-12-17 15:33:40 浏览量：次

摘要：从土壤中分离筛选出5株产胞外β-甘露聚糖酶的菌株，其中DK3菌株的摇瓶培养液的酶活力达3.85 U /ml。该酶水解葡甘露聚糖的最适温度为37℃，最适pH为6.0，pH稳定范围为5.0~9.0 ，在低于40℃的温度下基本稳定。Fe ²⁺ 、Cu²⁺、EDTA和NH₄⁺对该酶有抑制作用，Na⁺则有激活作用。

关键词： β-甘露聚糖酶；筛选；酶学性质

β-1,4-D-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannanohydrolase，EC.3.2. l. 78)是一类能水解含有β-1,4-D-甘露糖为主链的多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘聚糖等)的内切酶^[1]。该酶用途广泛，能分解魔芋葡甘露聚糖，生产能促进双歧杆菌生长、改善肠道菌群结构的魔芋低聚糖；可作为工具酶用于天然多糖类结构的分析；在造纸工业中，与β-木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用，能除去纸浆中的半纤维素，改善纸质；在纺织工业中用于纤维中半纤维素的降解，能有效去除纺织品所粘附的多余染料；在饲料工业中用作酶添加剂，起到消除抗营养因子的作用^[2-4]。虽然β-甘露聚糖酶的应用前景广阔，但目前总的来说，其低产和高成本限制了其应用范围和规模，能改变这种状况的最重要的途径之一是筛选和培育产高活力β-甘露聚糖酶的高产菌株。

1 材料与方法

1.1 土壤来源

土壤样品从广西大学农场甘蔗地、广西南丹县魔芋种植地和南宁绿源肥料厂堆肥地采集。

1.2 试剂

葡甘露聚糖（商品名：魔芋精粉）购自武汉市清江魔芋制品有限公司。

其它试剂均为分析纯试剂。

1.3 培养基

富集培养基（%）：魔芋精粉2.0，酵母膏0.5，蛋白胨0.3，NaCl 0.5；

固体分离培养基（%）：魔芋精粉1.0，NaNO₃0.3，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl 0.5， K₂HPO₄0.1，FeSO₄·7H₂O 0.001，琼脂 1.0，pH6.0；

发酵培养基（%）：魔芋精粉1.0，酵母膏0.5，蛋白胨0.3，NaNO₃0.3，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl 0.5，K₂HPO₄0.1，FeSO₄·7H₂O 0.001，pH6.0；

产酶培养基（%）：魔芋精粉1.0，NaNO₃0.3，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl 0.5，K₂HPO₄0.1，FeSO₄·7H₂O 0.001，pH6.0。

1.4 菌株的分离和筛选

称取1 g土壤于试管中，加入l0ml蒸馏水，振荡混匀，取l ml接种到富集培养基中，37℃，160 rpm培养24 h。选择培养液粘度明显下降的菌液，用无菌水梯度稀释后涂布于固体分离培养基中，置 37℃培养箱中培养24 h，用刚果红染色，观察菌落周围有无透明圈，挑取透明圈大的单菌落进行划线纯化。经纯化后的菌株在发酵培养基中培养24 h，测定培养液中β-甘露聚糖酶的活力，筛选出酶活力高的菌株。

1.5 β-甘露聚糖酶粗酶液的制备

将菌株接种于发酵培养基中，37℃培养24 h，按l %比例接入产酶培养基中，37℃，160 rpm培养24 h。发酵液离心所得上清液即为粗酶液。

1.2.4 β-甘露聚糖酶酶活力的测定

酶活力的测定：取0.4 ml 0.5%(w/v)葡甘露聚糖 (用pH7.0，0.01 mol/L 磷酸钠缓冲液配制)，加入0.1 ml 适当浓度的酶液，37℃水浴反应15 min，用DNS法测定所产生的还原糖^[7]。

酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟由底物释放出相当于1µmolD-甘露糖的还原糖所需酶量为1个酶活力单位(U)。

2 结果

2.1 菌株筛选

从土样中筛选出5株产β-甘露聚糖酶的高产菌株（编号为DK1~5）,其中DK3菌株的摇瓶培养液的粘度下降快，菌落周围有大的透明圈，摇瓶培养液中的β-甘露聚糖酶活力达3.85 U /ml （表1）。

表1 菌株筛选结果

菌株编号

β-甘露聚糖酶活力（U / ml）

DK1

DK2

DK3

DK4

DK5

2.21

2.42

3.85

3.30

3.00

2.2 酶学性质的研究

2.2.1 温度对酶活力的影响：在30~70℃下测定β-甘露聚糖酶的活性，结果表明，该酶分解葡甘露聚糖的最适温度为37℃，在30~45℃都具有较高的活力（图1）。

图1 β-甘露聚糖酶促反应最适温度

2.2.2 温度对酶稳定性的影响：将酶液分别置于40、50、60℃恒温水浴中处理，每隔20 min取样，测定残留酶活力（以未经处理的酶液作对照）。结果表明，该酶在40℃下相对稳定（图2）。

图2 β-甘露聚糖酶的温度稳定性

2.2.3 p聚糖甘露筛选探讨性质