卷烟烟气中R-(+)-尼古丁形成机理的研究

摘要　采用多维气相色谱法测定了烟草和烟气中尼古丁的手性纯度。尽管在烟草中几乎检测不到右旋的尼古丁，但在卷烟烟气中R-(+)-尼古丁的相对比例达2.6-3.6%。关于烟气中R-(+)-尼古丁的形成机理，文献中有两种理论假设，但都没有用实验证实。在本研究中，为探索吸烟过程中R-(+)-尼古丁的形成机理，采用微炉裂解器，对S-(-)-尼古丁和烟草样品进行热裂解，采用多维气相色谱法分析裂解物中尼古丁的手性纯度。结果显示，无论是尼古丁化学品还是烟草样品，S-(-)-尼古丁的消旋化与热裂解的进程高度同步。另外，在550。下，尽管纯S-(-)-尼古丁试剂的消旋化程度显著高于烟草中的S-(-)-尼古丁，但是不同类型烟草中的S-(-)-尼古丁的消旋化程度非常接近。因此，本研究为高温消旋化的假设提供了实验支持，即吸烟过程中的高温是导致S-(-)-尼古丁消旋化的主要动力。在一定温度下，气态S-(-)-尼古丁可逆地失去手性中心上的氢原子，形成尼古丁自由基，重新与氢结合，形成外消旋尼古丁混合物。多维气相色谱的预柱为DB-1(30m×0.25mm i.d ×()．25μm)，手性柱为DB-C：Cydodex-B(60m×0．25mm i．d．×().25μm)。FID和NPD分别为监视检测器和分析检测器。

　　关键词 尼古丁 消旋化 手性 热裂解 多维气相色谱 烟草 烟气

　　1引言

　　尼古丁是烟草和烟气中含量最丰富的一个生物碱。尼古丁是手性分子，手性中心是四氢吡咯环-2-位碳原子，所以，尼古丁可以两个对映体存在：S-(-)-尼古丁和R-(+)-尼古丁。旋光对映体通常显示完全不同的代谢和生理特性，所以，手性分析具有重要意义。一系列动物实验和体外细胞试验显示，S-(-)-尼古丁的生理活性比R-(+)-尼古丁更强[1]．毒性试验显示，S-(-)-尼古丁的毒性比R-(+)-尼古丁更强[2]．天然烟草中的尼古丁主要是S-(-)-构型，但是，采用较灵敏和准确的手性分析方法，可在不同类型的烟草原料中检测到0.2-0.3%的R-(+)-尼古丁(相对于总尼古丁含量)[3].在卷烟烟气中，R-(+)-尼古丁的相对比例大大高于烟草[4]；根据最近的文献，在六个肯塔基参考卷烟主流烟气中，R-(+)-尼古丁相埘比例为3%左右[2]。关于卷烟烟气中尼古丁的形成机理，Crooks等人提出了两个假设[5]，雷诺公司Perfetti and Coleman进行了相关研究[2，6]，但是相关的机理仍然没有弄清楚[7]。

　　裂解气相色谱一质谱揭示烟气成分形成机理的重要研究手段[8-9]。在本研究中，采用裂解和中心切割式手性多维气相色谱(MDGC)[10]，对温度和尼古丁手性变化关系进行了深入研究。另外，对烟草和烟气中尼古丁的手性组成也进行了测定。

　　2实验

　　2.1试剂与材料

　　除非特别说明，所用试剂均为分析纯。外消旋尼古丁标样(S-/R-，1/1)购自Sigma Co(USA)．商品卷炳购自当地市场。烟叶原料取自上海烟草(集团)公司。

　　2.2烟草萃取

　　称取30 mg烟末，加入5 mL乙酸乙酯和1 mL10%NaOH，剧烈振荡充分混匀。离心，取上清液1.0 mL转移到2 mL GC样品瓶中，进行MDGC分析。

　　2.3烟气分析

　　卷烟抽吸采用IS03308标准[11]，用RM-20020-孔道转盘吸烟机(Borgwaldt Technik GmbH，Germany)。20支卷烟的主流烟气收集到92 mm直径的剑桥滤片上，然后用20 mL甲基叔丁基醚萃取，取1 mL萃取液转移到2 mL样品瓶中，进行 MDGC分析。

　　2.4 MDGC条件

　　把MDS 6890多维附件(SGE，Australia)安装到Agilent 6890 GC(Agilent Technology，USA)，构建MDGC系统。载气为高纯氦(99.999%)。预柱DB-1,30m×0.25mm i.d.×0.25μm膜厚(Agilent， USA).手性柱DB-Cyclodex-B，60m×0.25mm i.d.×0.25μm膜厚(Agilent Technologies,USA)．手性固定相是10.5%全甲基化β-环糊精分散到DB-1701[14%(cyanopropylphenyl)methylpolysiloxane]中。预柱和分析柱的载气流速分别为1.9 and 2.7 mL/min。一维色谱的柱温程序：初温100℃，升温到200℃，速率8℃/min，保持5 min。尼古丁的一维保留时间为9.0 min，所以中心切割范围选择8.8到9.2 min。液态C0，为冷却剂，打开时间为7 min，关闭时间为13 min。手性分离的炉温程序：初温50℃，升温至130℃，速率0.5℃/min，然后以10℃/min升温到180℃，保持5 min，一维色谱检测器为FID，FID温度250℃，氢气流速40 mL/ min，空气流速350 mL/min，补充气(氦气)流速30 mL/min。手性柱检测器为NPD，NPD温度320℃，氢气流速2 mL/min，空气流速60 mL/min，补充气(氦气)流速10 mL/min，铷珠电压3.80V。分流/不分流进样口温度250 0C，进样量3．0μL，分流流量30 mL/min。

　　2.5裂解买验

　　2.5.1裂解-MDGC

　　微炉裂解器(Pvroiector II，SGE，Australia)直接与MDGC联用。裂解温度范围为300-700℃，温度间隔为50℃。载气为氦气，压力比气相色谱进样口高出5 psi。溶液样品采用SGE液体进样针(70 mm针头)将1 uL S-(-)-尼古丁溶液(戊烷中，1.0mg/mL)注入裂解器。烟末样品采用SGE螺旋进样针进样，但是气相色谱分流流量由30 mL/ min增加到200 mL/min，目的是防止尼古丁响应信号太高而影响手性分离效果。

　　2.5.2裂解-GC/MS

　　SGE螺旋针头进样器的进样量重复性有一定局限，为了更准确地获得烟草裂解产物中尼古丁的峰面积，改用SGE pelletizer固体进样器，精确称取1.0 mg烟末注人裂解-GC/MS，考虑到烟草裂解产物组成复杂，采用质谱-萃取离子(m/z84)计算尼古丁的峰面积。

　　GC/MS分析条件：毛细管色谱柱DB-1，30m×0.25mm i.d.×0.259μm膜厚(Agilent，USA)，载气为氦气，恒流流速1.0 mL/min，分流流量100 mL/min．炉温从40℃(保持2.0 min)升至280℃(4℃/min)(保持5 min)。MSD扫描范围33-350 D。MS接口、离子源和四极杆温度分别为280，230 and 150℃。

　　3结果与讨论

　　3.1尼古丁对映体的手性分离

　　烟草和烟气中尼古丁的手性分离具有一定难度，目前仅少量几种测试方法报道[4]，包括1H- NMR，手性HPLC和手性GC/MSD-SIM[4]。1H- NMR和手性HPLC一般需要复杂的样品纯化手续，步骤多，耗时长。本文MDGC方法是在Perfeni and Coleman的手性GC/MS-SIM方法[2]的基础上发展起来的。主要的技术改进是，首先，考虑到烟草和烟气的复杂性，采用二维气相色谱取代一维色谱，有效消除基质干扰。其次，对手性色谱柱进行了重新选择，用一根DB-Cyclodex-B column(60 m ×0.25 mmi.d.×0.25 μm膜厚柱取代文献中的串联色谱柱。本研究发现，一根60米的 DB-Cyclodex-B手性色谱柱对尼古丁的手性分离能力，远远优于文献中的串连手性柱(DB- Cyclodex-B柱与Rt-β-DEXsm柱相连，规格均为30m × 0.25 mm i.d.×0.25μm膜厚)[2].

　　尼古丁外消旋混合物手性分离的色谱图见图1。尼古丁对映体达到基线分离，为手性组成的准确定量奠定了基础。

　　3.2尼古丁手性组成的检测限

　　尼古丁手性组成通常以R-(+)-尼古丁占总尼古丁的百分比来表示。为衡量检测限，理想的办法是在纯S-(-)-尼古丁中添加右旋对映体。但遗憾的是，商品s-(-)-尼古丁试剂中通常含有微量的右旋对映体杂质，右旋对映体含量一般为0.2-0.9%[3]。在本研究中，我们也在一个s-(-)-尼古丁试剂中检测到约1%的右旋杂质。比较而言，天然烟草中R-(+)-尼古丁含量反而更低一些，一般只有0.2-0.3%[3]。因此，在本研究中，为了评估对R-(+)-尼古丁的检测能力，我们把一定量尼古丁外消旋混合标样加入烤烟萃取物(在该烤烟萃取物中检测不到R-(+)-尼古丁)，结果表明，当 R-(+)-尼古丁的加入量达到0.2%(相对于总尼古丁含量)时，就可观察到R-(+)-尼古丁的响应信号。假定该烟草样品中R-(+)-尼古丁相对含量为0.3%，那么本方法对R-(+)-尼古丁的检测限约为0.5%。国外文献中R-(+)-尼古丁的检测限约为2.0%[2]，说明本方法的灵敏度显著提高。

　　3.3烟草和烟气中尼古丁手性组成研究

　　共测定了20个烟草样品，包括12个烟叶原料和8个卷烟烟丝样品。仅在2个香料烟和1个烤烟中发现了R-(+)-尼古丁的信号，其中1个香料烟的色谱图见图2，其中R-(+)-尼古丁相对含量约0.5%。这个结果也表明，天然烟草中尼古丁绝大部分是以左旋形式存在的。

　　测定了8个成品卷烟的主流烟气，其中一个烟气的色谱图见图2。与烟草相比，卷烟烟气中R-(+)-尼古丁相对含量显著增加。采用色谱工作站自动积分(基线到基线模式)，定量结果见表1。卷烟主流烟气中R-(+)-尼古丁的相对含量范围是2.6 t0 3.6%，本结果与文献中六种肯塔基参考卷烟主流烟气的测定结果较为接近[2]。

　　3.4 S-(-)-nicotine试剂的热消旋化和热分解过程考察

　　在不同裂解温度下，裂解一手性MDGC色谱图如图3所示。R-(+)-尼古丁相对含量随温度的上升而增加，尼古丁峰而积则随着温度的上升而减少。

　　裂解温度对尼古丁旋光组成和色谱峰面积的影响分别如图4和图5所示。在温度为300-400℃时，尼古丁相对稳定，同时R-(+)-尼古丁的相对比例随温度的上升而略有增加。从450-550℃，尼古丁热分解开始加速，同时R-(+)-尼古丁的相对比例也迅速增加。当温度达到550℃时，R-(+)-尼古丁的比例达到21.8%。裂解温度达到600℃，裂解产物中几乎检测不到尼古丁。比较图4和图5，可以发现，S-(-)-尼古丁热消旋化曲线和热分解曲线几乎是对称的。

　　因此，对s-(-)-尼古丁试剂来说，热消旋化与热裂解的过程具有高度的同步性。

　　3.5烟草中S-(-)-尼古丁的热消旋化和热分解过程考察

　　根据pelletizer固体进样和GC/MS-总离子流萃取离子(m/z84)峰面积数据，烟草裂解温度对尼古丁峰面积的影响规律见图6。该烟末来自表1中的第5号卷烟。烟草裂解温度对尼古丁手性组成的影响见图7。比较图6和图7，可以发现，烟草中的尼古丁比纯化学试剂更加稳定，在300-500℃温度范围内，尼古丁分解不明现，同时烟草裂解产物中R-(+)-尼古丁的相对比例仅略微增加。在550-600℃范围内，烟草中尼古丁的热分解进程突然加快，同时，R-(+)-nicotine比例也突然增加。在550 and 600℃下，R-(+)-尼古丁相对比例分别达到15.7%和25.9%。当温度升高到650℃，手性MDGC几乎检测不到尼古丁，GC/MS总离子流色谱中尼古丁的信号也较小。当温度升高到700℃，尼古丁色谱峰消失。图6和图7中两个曲线也几乎是对称的。

　　烟草裂解分析结果也显示，烟草中尼古丁的热分解和s-(-)-尼古丁的消旋化过程也存在高度的同步性。

　　烟草中尼古丁一般是以有机酸盐的形式存在的，所以显示出更好的热稳定性能。但是，一旦温度超过500℃，有机酸烟碱盐分解，尼古丁的热裂解进程迅速加快。

　　在本研究中，对不同类型的烟草材料进行了裂解和手性MDGC分析，其中550℃的测定结果见表2。在相同的裂解温度下，尽管纯S-(-)-尼古丁试剂的消旋化程度显著高于烟草中的s-(-)-尼古丁，但不同类型烟草中的S-(-)-尼古丁的消旋化程度非常接近。这也说明，温度是烟草中S-(-)-尼古丁发生消旋化的主要动力。3.6卷烟烟气中R-(+)-尼古丁的机理关于卷烟烟气中R-(+)-尼古丁的形成机理， Crooks等人[5]提出了两种理论假设，第一个假说认为，在卷烟燃烧的高温下，烟草中S-(-)-尼古丁消旋化形成R-(+)-尼古丁并转移到烟气中。第二个假说认为，卷烟烟气气溶胶存在大量的甲基自由基，与烟叶中的R-(+)-降烟碱结合，形成了 R-(+)-尼古丁。

　　为了证实第二个假说，Perfetti and Coleman[6]做了实验探索。通过烟草外的加入方式，即把 s-或R-降烟碱加入参比卷烟，结果主流烟气中 R-(+)-尼古丁相对比例不变。还通过烟草内部的添加方式，即把S-(-)-降烟碱含量很高的烟叶加入配方，结果主流烟气中R-(+)-尼古丁相对比例也没有变化。以上结果说明，第二个机理可能是不存在的。

　　本研究的目的是证实第一个机理。根具本实验的结果，无论S-(-)-尼古丁是纯试剂状态还是存在于烟草中，消旋化和热分解的发生过程都具有高度的同步性。换句话说。温度是S-(-)-尼古丁消旋化的主要动力。所以，本研究提供的证据支持第一个机理。具体的反应机理可用图8来说明，在高温下，气态S-(-)-尼古丁分子可逆地失去手性中心上的氢原子，形成尼古丁自由基，在重新与氢结合的过程中，形成R-(+)-尼古丁。

　　根据我们有限的知识，这是国内外首次利用实验证实烟气R-(+)-尼古丁的形成机理。

　　根据Baker的描述[12]，卷烟燃烧锥温度为700-950℃，紧接燃烧锥的是裂解-蒸馏区，温度为200-600℃，大部分烟气气溶胶是在裂解蒸馏区形成的。根据本研究，烟草S-(-)-尼古丁的热裂解和消旋化的发生温度为550-600℃，也在卷烟的裂解-蒸馏区。从这一点来说，热裂解的确是研究卷烟烟气成分形成机理的一个强有力的分析手段。

　　但是也应指出，采用热裂解手段，烟草S-(-)-尼古丁的消旋化程度被显著夸大了。在卷烟烟气中，R-(+)-尼古丁的相对比例仅3%左右。但在烟草裂解产物中，在550℃，时，R-(+)-尼古丁的相对比例为15.7%；在600℃下，R-(+)-尼古丁的相对比例达到25.9%，都大大高于烟气中R-(+)-尼古丁的相对比例。大量文献表明，在模拟卷烟燃吸过程方面，管式裂解炉通常夸大了烟草化学成分的裂解程度。本研究从S-(-)-尼古丁的消旋化角度，也说明了这一点。为了更贴切地模拟卷烟燃烧过程，Baker and Bishop[2]采用热丝裂解器并设定温度程序，可较好的解决了管式炉的过度裂解问题。但是，我们认为，热丝裂解器可能会过低估计烟草化学成分的裂解程度。热丝裂解器的进样温度为250-300℃，尼古丁是半挥发物，大部分尼古丁可能未来得及进行高温裂解，就已经从烟草中脱附并进入色谱仪。在今后的研究中，我们将应用热丝裂解方式，并与管式炉的裂解分析结果进行比较。所以，本研究对今后烟气成分形成机理和更合适裂解条件的探索，也具有重要的指导价值。

参考文献
　　[1] P. J. Jacob, Ⅲ and G. D. Byrd, In: J. W. Gorrod, J. Pevton Ⅲ (Eds.), Analytical determination of nicotine and related compounds and their metabolites, Elsevier, Amsterdam, 1999, p191.
　　[2] T. A. Perfetti , W. M. Coleman Ⅲ, Beitr. Tabakforsch.Int. 18 (1998) 15.
　　[3] D. W. Armstrong, X. Wang, Chirality 10 (1998) 587.
　　[4] K. Rustemeier and lean-Jacques Piad é, In : J. W. Gorrod, J. Peyton Ⅲ (Eds.), Analytical determination of nicotine and related compounds and their metabolites, ElSevier, Amsterdam, 1999, p489.
　　[5] P. A. Crooks, C. S. Godin and W. F. Pool, Med. Sci. Res. 20(1992)879-880.
　　[6] T. A. Perfetti , W. M. Coleman III, Beitr. Tabakforsch. Int. 18 (1998) 35.
　　[7] T. A. Perfetti , W. M. Coleman III and W. S. Smith, Beitr. Tabakforsch. Int. 18 (1998) 95.
　　[8] Sufang Wang, Baizhan Liu, Qingdesu, J. Anal. Appl. Pyrolysis 71 (2004)393.
　　[9] W. S. Schlotzhauer, O. T. Chortvk, J. Anal. Appl. Py rolysis 12(1987)193.
　　[10] S. C. Moldoveanu, in S. C. Mokdoveanu (Eds.), Sample preparation in chromatography, Elsevier, Amsterdam,2002, p403.
　　[11] International Organization for Standardization: Inter national Standard ISO 3308, 1991. Routine analytical cigarette-smoking machine·Definitions and standard conditions, 3rd edition.
　　[12] R. R. Baker, L.J. Bishop. J. Anal. Appl. Pyrolysis. 71(2004)223.

推荐访问:尼古丁 烟气 机理 卷烟 研究