(1内蒙古农业大学 生物工程学院；2内蒙古农业大学 林学院，内蒙古 呼和浩特 010018)
摘 要： 为了寻找褐环粘盖牛肝菌的最佳培养条件，本实验以Pach培养基为基础培养基，通过液体培 养，在缓冲体系(磷酸二氢钾——柠檬酸缓冲液,缓冲液按体积占培养基总体积20%)和非缓 冲体系下，比较研究了接种量(分别为1，2，3，4，5块，每块大小为5×5mm2，选生命力 强的菌丝)和pH(分别为2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5)对褐环乳牛肝菌(SP9)生长的 影响。结果表明：褐环粘盖牛肝菌生长的最适pH为4.5左右，最佳接种量为4块。添加了缓冲 液的菌丝生长更旺盛。
关键词：褐环乳牛肝菌；pH值；接种量
中图分类号：S718.52 文献标识码：A 文章编号：[ HTK]1007—6921(2008)22—0029—03
褐环粘盖牛肝菌 ［Suillus luteus (L.:Fr) Gray］隶属于担子菌纲、伞菌目、牛肝菌科、 粘盖牛肝菌属,是一种能与松属植物共生的菌根真菌，它可以产生多种植物生长激素和生长 调节物质，促进林木发育。对其宿主植物在逆境(干旱，盐碱，病害)中的生长和发育有着积 极作用。将其做成菌根菌剂后将有巨大的市场空间，能取得明显的增产效果和经济效益。该 菌的子实体不但营养丰富，还可以入药，有较高的食用价值和药用价值。但其人工培养生长 缓慢，老化快，使其生产、应用甚至研究都遇到了很大的困难，研究环境条件对其影响是寻 找其快速高效培养的重要手段之一。pH值是影响褐环乳牛肝菌生长的重要因素,因而也受到 了众多研究者的关注，但关于该菌生长的最适pH条件的研究，不同的研究者得出的范围相差 很大。雷增普等在田间试验中发现褐环粘盖牛肝菌具有抗碱(土壤pH8.6)的能力［1］。赵志鹏等室内纯培养结果表明褐环粘盖牛肝菌喜中性生长条件［2］。张茹琴利用 纯培养方法测定了pH值对粘盖牛肝菌、褐环粘盖牛肝菌和褐黄牛肝菌3种外生菌根真菌生长 的影响,以及重金属处理和外生菌根真菌培养前后培养基pH值的变化［3］。结果表明 ,在pH值4.1～7.1的范围内3 种外生菌根真菌均可生长,其中褐环粘盖牛肝菌为5.3～6.7。而陈连庆等人研究表明pH4.5时 褐环粘盖牛肝菌生长最好［4］。刘杨研究发现缓冲浓度在30～40%，接种量为三块时 最佳pH值是4.5［5］。造成这些差异的原因可能很多，如菌株来源不同，研究方法不 同等，但有一点可以肯定，过去的研究中并没有考虑，菌的活动会使其环境pH发生变化，菌 的生命活动引起其环境pH发生改变，使得菌生长在一个pH不断变化的环境中，初始pH并非是 菌丝生命活动所真正经历的pH条件。因而要把握其生长最适的pH必须了解其对环境pH的影响 ，或者尽量控制其生长环境的pH条件，为此本文比较研究了缓冲体系和非缓冲体系中接种量 对环境pH及其生长的影响。
1 实验材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株来源。SP9是褐环乳牛肝菌的一个菌株，是从大青山油松(Pinus tabulaeformis )菌根上分离获得的。
1.1.2 基础培养基的组成。本实验以Pachlewski(简称Pach)培养基为基础培养基，培养基 成分见表1：
1.2 实验方法
1.2.1 实验处理。
本实验分为有缓冲体系和无缓冲体系两类处理,每个体系下又设6个pH水平，分别为2.5、3.5 、4.5、5.5、6.5及7.5,每个pH水平菌丝接种量分别是1、2、3、4和5块，不设重复。缓冲体 系按照2.1.3中缓冲液的组成配制, 缓冲液按占培养基总体积20%的浓度加入培养基。无缓冲 体系用KOH和HCl调节pH值。
1.2.2 培养条件。
本实验所需菌种量大，需先对SP9进行扩大培养，将菌种用接菌刀分割成边长为5mm左右的小 块，接入基础培养基中，每个培养皿接3块。25℃下培养一星期后，选取长势良好的菌种， 在超净工作台中使用双层刀片切取大小相同边长5mm左右的菌块，用接种刀分别接入液体培 养基中，25℃恒温培养箱中静置培养30天。
1.2.3 生物量的测定。
将菌丝从液体液体培养基中取出，蒸馏水冲洗3次后收集菌丝，再于烘箱中60℃烘干，万分 之一天平测量干重。培养后的培养液用PHS-3B精密pH计测定pH值，用分光光度计测定测200 ～1 000nm的吸光度以显示色素分泌程度。
2 结果与分析
2.1 褐环粘盖牛肝菌在不同pH条件下的生长情况
由图1可知在含有缓冲液的培养基中褐环乳牛肝菌菌丝生长明显比非缓冲体 系旺盛，图中还显示，在pH<4.5的条件下，菌丝生物量随pH的升高而增大；在pH>4.5的条件 下，菌丝生物量随pH的升高而减小。pH>5.5的条件下30天左右的培养期内菌丝未见生长。培 养基初始pH在2.5～5.5范围内，菌丝生物量与pH值之间具有二次曲线型关系。相关分析显示 ，当接种量为4块时，在pH2.5～5.5范围内，菌丝生物量与pH值之间具有显著的相关关系(非 缓冲体系的回归方程是：y=-0.0696x2+0.5773x-0.9995，相关系数为r=0.9995>r0.05=0.999；缓冲体系的回归方程是y=-0.141x2+1.1462x-1.9777,相关系数为r=0.9991> r0.05=0.999)。
2.2 褐环粘盖牛肝菌在不同接种量下的生长情况
由 图2和图3可知，在各接种量下，缓冲体系下的菌丝生物量均比非缓冲体系下的菌丝生物量 大，缓冲体系和非缓冲体系下的菌丝生物量随接种量的变化均呈二次曲线型关系，但在各pH 条件下菌丝生物量随接种量的变化趋势有明显的不同，pH为2.5和7.5的条件下，随接种量的 增大菌丝生物量呈递增趋势，而pH为4.5时，随接种量的增加菌丝生物量的变化为二次曲线 ，接种量为4块时菌丝生物量最大。本次实验中褐环乳牛肝菌(SP9)接种每块的大小为5×5 mm2,液体培养基为50mL时,最佳接种量为4块。.gif)
2.3 褐环粘盖牛肝菌培养后残液的pH变化对菌丝生长的影 响
由图4可知：培养了褐环乳牛肝菌的残液随生物量的增加pH变化的绝对值整体呈增长趋 势，并且非缓冲体系的下降要大于缓冲体系。这说明添加了缓冲液后对菌丝生长环境的pH条 件的改变起到了控制作用。初始pH值为4.5时，基质的pH下降幅度最大，缓冲体系达到了1.0 个pH单位，非缓冲体系下达到2.36个pH单位，其次是pH值为5.5，缓冲体系下残液的pH变化 幅度达到了0.8个pH单位，非缓冲体系下达到1.5个pH单位。在高pH条件下，菌丝生物量变化 不大，基质的pH值却仍有一定程度的下降，这种现象可能是由于①在接种过程中带入了 少许的固体培养基，从而造成了基质的pH值的下降；②菌丝在生长过程中改变周围环境 的能力较强，而这种高pH条件并不利于菌丝的生长，所以菌丝在生长过程中为了克服这种不 利条件便通过分泌一些物质来调节改善生长环境，而分泌的物质引起了pH值的下降。综合上 述分析可知， pH下降度与菌丝的生物量呈正相关。初始pH值为4.5左右时，菌丝生长速度最 快，pH下降最大，改变周围环境的能力也最强。
2.4 培养基残液的吸光度
根据图5～图7的吸收光谱曲线分析可以得出，各pH条件下的菌丝培养残液均有吸收峰， 这表明各pH条件下生长的菌丝均有色素分泌。但各pH条件下的光谱形状不同，在pH为2.5时 ，菌丝残液吸收光谱有两个明显的吸收峰分别在260nm左右。在pH3.5～5.5的范围内培养残 液的吸收光谱出现了三个吸收峰，其中波长在300～400nm之间出现了第三个不明显的吸收峰 。pH为6.5～7.5的范围内残液吸光光谱只有两个吸收峰，波长在200～300nm之间第二个吸收 峰 不明显，短波长下吸收峰值较大，长波长下吸收峰值较小。图8显示的是pH为4.5接种量为4 块时缓冲体系和非缓冲体系下残液的吸收光谱，缓冲体系下三个吸收峰值均大于非缓冲体系 ，但缓冲与非缓冲体系下残液吸收峰的峰位大致相同。根据各个光谱图分析找到生长过褐环 乳牛肝菌培养残液在223nm、262nm、370nm这三个波长处有吸收峰。
图9～11分别为菌丝在223nm、262nm、370nm这三个 波长吸光值随pH的变化曲线，这三滚变化曲线均呈单峰曲线型，均为随pH的增加吸光值呈先 变大后再减小的趋势。波长为223nm处 峰位在4.5～5.5范围内，峰值不明显。波长为262nm处峰位在pH4.5左右，峰值明显。波长为 370nm处pH为4.5～6.5之间，峰值不明显。结合菌丝干重实验结果分析后可知，pH为4.5左右 菌丝生物量最大，吸光度也最大，吸光度与菌丝干重有正相关关系。说明菌丝在活动过程中 向培养基中分泌了有色物质，菌丝长势越旺盛，生物量越大，分泌色素的能力越强。而pH过 高或过低能抑制菌丝色素的分泌。
3 小结
褐环粘盖牛肝菌(SP9)生长的最适pH范围在4.5左右，在液体培养基为50ml的条件下,接种 生长旺盛的菌每块大小为5×5mm2,最佳接种量为3～4块。褐环粘盖牛肝菌培养残液的pH下 降幅度及褐环乳牛肝菌的色素分泌量均与菌丝的生物量呈正相关。添加了缓冲液的培养体系 菌丝的生长较旺盛，非缓冲体系下的液体培养是利用酸或碱调节初始pH值进行培养，但是该 菌在生长过程中改变周围环境pH的能力较强，培养基缓冲能力比较弱，分泌酸性物质增多到 一定程度后可抑制菌丝生长。
这一实验结果为研究pH值和接种量对褐环乳牛肝菌生长的影响提供了一个理论依据，并为合 理有效的确定pH对这类菌生长及生命活动影响的方法奠定了一个基础，在褐环乳牛肝菌的菌 丝体扩繁的研究中具有很大的借鉴意义。
［参考文献］
［1］ 雷增普，罗晓芳，王昌温.外生菌根菌对油松苗木猝倒病的生物防治效应［J ］.北京林学院报，1983，5(1)：81～94.
［2］ [ZK(]赵志鹏，郭秀珍.外生菌根真菌纯培养的生态学研究［J］.林业科学研究，1 989，2(2)：136～141.
［3］ 张茹琴，唐明，张峰峰，等.酸碱度和重金属对3种外生菌根真菌生长 的影响［J］.北京林业大学学报，2008，30(2)：145～150.
［4］ 应国华，吕明亮，陈连庆.褐环粘盖牛肝菌菌种分离研究［J］.林业科学研 究，2004，17(1)：66～71.
［5］ 刘杨，陈有君，闫伟.pH条件和缓冲体系对粘盖牛肝菌生长影响的研究［J］ .辽宁大学学报，2007,6,(5)：76～78.