[关键词] 叶下珠；纤维素酶；总多酚 ；正交实验法；提取工艺
[中图分类号]S792.95 [文献标识码] A [文章编号]
[作者简介] 杨再雍(1980—)，男，广西百色人，广西大学化工学院硕士研究生，研究方向：中草药的提取与分离；刘琨(1962—)，女，博士，广西大学化学化工学院教授，研究方向：化学工程与工艺。
叶下珠（Phyllanthus urinaria L.）又名珍珠草,为大戟科柚柑属植物的全草, 最早收载于《生草药性备要》中, 具有平肝清热、利水解毒和明目等功效之效, 主要用于治疗肠炎、腹泻、肝炎、痢疾、尿路感染、无名肿痛等疾病[1,2]。现代药理实验证明叶下珠具有极强的抗乙肝病毒和保肝作用[3,4]。2002年8月广西医科大学完成“抗乙肝表面抗原中草药的筛选”工作，对200种中药进行体外、体内研究证实，只有珍珠草和五倍子对乙肝表面抗原有效[5]。仲英[6]等通过对叶下珠系统的化学药理研究及初步临床观察,充分显示了叶下珠的抗乙肝病毒和保肝活性,且毒性较低,是一种很有开发前景的中药。
文献报道，叶下珠中所含的主要活性成分为没食子酸（gallic acid）、短叶苏木酚酸
1 仪器、试剂和样品
1.1 仪器
PHS
1.2 试剂
纤维素酶(上海源聚生物科技有限公司)，活力为750u/mg；没食子酸标准品（天津市大茂化学试剂厂）；其它试剂均为分析纯。
1.3 样品
珍珠草（南宁元桂中药饮片有限责任公司），经广西药用植物园鉴定。
2 方法与结果
2.1 方法
叶下珠干品→粉碎过筛(取40～60目)→称量→加水→调pH值→加入一定量的酶搅匀→提取→离心过滤→正丁醇萃取→浓缩干燥→提取物
采用普鲁士蓝方法测定了叶下珠中总多酚的含量。其反应原理为酚羟基具有还原性，能将Fe(CN)63-还原成Fe(CN)64-，还原产物Fe(CN)64-接着与Fe3+反应生成Fe[Fe(CN)6]3(普鲁士蓝)供定量测定。
精密称取没食子酸对照品25mg于50mL量瓶中,30%甲醇水溶解并加至刻度, 得到0.5mg/mL的对照品溶液。精密吸取该溶液1mL于10mL量瓶中, 加入30%甲醇水至刻度, 配成50ug/mL对照品溶液。
精密吸取上述对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25mL 量瓶中, 依次加入0.100mol/L 三氯化铁溶液0.5mL、0.008mol/L铁氰化钾溶液0.5mL 和0.10 mol/L 盐酸溶液0.5mL , 定容, 得到不同浓度的对照品溶液。同时在25mL量瓶中加入0.100 mol/L 三氯化铁溶液0.5mL、0.008 mol/L 铁氰化钾溶液0.5mL 和0.10mol/L 盐酸溶液0.5mL , 定容后得到空白溶液。随行空白, 在695nm 波长处测定吸光度。以对照品的质量浓度为纵坐标, 吸光度为横坐标, 绘制标准曲线, 得线性回归方程C=2.1061A-0.0612, r=0.9992, 结果表明没食子酸在0.4～2.0ug/mL时,质量浓度与吸光度呈良好的线性关系。
取珍珠草纤维素酶法提取物0.1g, 精密称量, 加入40mL30%甲醇水, 置水浴中微沸浸提15min 后, 趁热抽滤, 冷却后定容至100mL。
取一份样品按上述方法制备成供试品溶液, 于0、1、2、3、4 h分别测定, 吸光度值RSD为1.41% (n=3)。
取同一份供试品溶液测定吸光度, 共测5次, 结果RSD为0.55% (n= 5)。
取同一批样品, 精密称取5份, 测定吸光度并计算多酚的质量分数, 结果RSD为2.21% (n=5)。
采用加样回收法。精密称取珍珠草提取物0.1g, 加入0.5mg/mL 对照品溶液3mL , 按上述样品制备和测定方法测定吸光度,并计算多酚, 结果平均加样回收率为98.73% , RSD为2.85% (n=5)。
2.2 结果
在试验预处理的基础上,考虑到各因素之间的相互关系,选取五个主要因素：温度、pH、料液比、加酶量、反应时间。每个因素拟4个水平，选用了L16（45）正交表。以进一步确定适宜的总多酚提取条件。选取因素水平见表1,实验结果及分析见表2。
表1 正交实验因素水平表
因素水平 | A温度（℃） | B pH | C料液比 | E加酶量(%) | D反应时间（h） |
30 | 4.0 | 1:20 | 0.5 | 2.5 | |
2 | 40 | 4.5 | 1:30 | 1.0 | 1.0 |
3 | 50 | 5.0 | 1:40 | 1.5 | 1.5 |
4 | 60 | 5.5 | 1:50 | 2.0 | 2.0 |