关键词：多糖；山楂叶；提取；分离
作者简介:黄飞（1975-），应用化学工程师，南宁新技术创业者中心主任科员，从事生物工程及制药行业管理工作；梁智群，广西大学博士生导师。
糖是α－碳原子上带有羟基的多羟基醛或多羟基酮，或能水解成这类化合物的物质。一般可分为四类：单糖、二糖、寡聚糖（一般含3个以上的单糖）和多糖（含10个以上的单糖）。其中，多糖是存在于自然界的醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的聚合物。按来源可分为细菌、真菌、藻类及动植物多糖；按化学组分可分为蛋白多糖、脂多糖及多糖缀合体；按生理功能分可分为储存多糖和结构多糖；而按存在场所又可分为细胞壁多糖、基质多糖和胞外多糖；此外，按组成多糖的单糖类型分还可分为同聚糖和杂聚糖。
多糖是天然的生物大分子物质，也是重要的生物大分子物质，它几乎存在于所有的有机体中，是有机体的能量主要来源，是一切有生命的有机体必不可少的组成成分，具有抗肿瘤、免疫、治疗心血管疾病、抗补体、降血压、降血脂等活性。70年代以来，随着人们对多糖认识的不断加深，多糖的作用越发显得突出，大量的药理和临床研究表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞，提高机体的免疫功能，而对正常细胞没有毒副作用，10多年来已逐渐发展为一种免疫疗法。到目前为止，已有300多种多糖类化合物从天然产物中被分离提取出来，其中从植物中提取的水溶性多糖最为重要，这一方面的研究日愈成为一大研究热点。
植物类多糖化合物由于它们的独特功能和很低的毒性，在临床应用中显示出越来越广阔的前景[1-3]，主要体现在以下几个方面：（1）抗肿瘤药：多糖免疫调节剂可与一些抗癌药合用，恢复由化疗引起的免疫功能低下，增强抗肿瘤的作用[4]。（2）治疗艾滋病(AIDS)等抗病毒药：目前现有的抗艾滋病药物毒性均较大，存在着严重的毒副作用，而硫酸化多糖以其能抑制逆转录酶活性、抑制靶细胞与病毒结合及增强机体免疫功能，没有大的毒副作用而很有希望成为高效低度的抗艾滋病药物。（3）抗衰老药：由于多糖类化合物可以增强老年人的免疫功能，因此很有希望将它们作为抗衰老药应用于临床[5]。
大果山楂（Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br）为蔷薇科植物山里红或山楂的干燥果实，为广西特产，主要产于靖西县。山楂常作为消食药，味酸、甘，性微温，有消食健胃行气散瘀、具有明显的降血脂和改善心脏等功能。用于肉食积滞，胃脘胀满，泻痢腹痛，淤血经闭，产后淤阻，心腹刺痛，疝气疼痛，高血脂症和改善心脏功能。其叶子的功用目前仅限于做茶饮料，其它功用还未有发现。本篇文章中，我们主要对山楂叶中多糖活性成分的提取、分离纯化进行研究，现将相关的过程、结果作一叙述。
1 材料与方法
1.1 材 料
真空抽提仪器一套， 电子继电器，贝克曼温度计，水银温度计，上海产电热恒温水浴锅，SHB-III型循环水式真空泵，上海RE-52旋转蒸发仪,美国BECKMEN J2-21型冷冻超速离心机,国产LXJ-II型离心沉淀机，组织捣碎机，索氏抽提器（又称为脂肪抽提器），重庆CS101型电热鼓风干燥机，1000ml容量瓶，摇床，离心机，分液漏斗,756MC紫外分光计，磁力搅拌器，美国LABCONCO 冻干机，美国REVCD SCIENTIFIC.INC超低温冰箱。
所有化学试剂均为分析纯或色谱纯试剂。
范围为3000～7000分子量的透析袋、透析袋夹。
1.2 实验方法
一般,粗品多糖的提取可由以下流程图来表示：
预处理→溶剂提取→初步纯化（去除杂质→初步提纯）→粗品多糖
首先，用组织捣碎机将山楂叶原料粉碎，将其放入纸杯中，之后，用索氏抽提器、甲醇或95%乙醇回流将原料中的脂质抽提出来，抽提过程大约为３～６个小时。抽提结束后，将纸杯中已脱脂的原料晾干或烘干。
具体操作如下：将晾干或烘干后的山楂叶原料样放入真空抽提器中，通过由电子继电器、贝克曼温度计、水银温度计、恒温水浴锅组成的控温抽提装置于60℃～80℃之间进行水提取,每回6ｈ，共三次。然后取上清液，去掉残渣备用。再将上清液通过减压浓缩至三到四倍，此时，可用三倍量的无水乙醇加入浓缩后的上清液中，放置8～10小时至沉淀完全，之后，将上清液去掉，此时所得的沉淀再进一步干燥即为粗品山楂叶多糖。
我们这里所说的杂质，是指粗品中除了多糖之外的物质，如蛋白质、色素、小分子物质以及低分子量的寡糖和有机物等。蛋白质的去除方法方面，经过重复的实验和对比，我们在这里是采取了Savage法。低分子量的小分子物质、寡糖和有机物等则主要通过透析除去，色素则一般是用过柱洗脱的方法除去。
（1）Sevage法除蛋白
将粗品多糖溶于一定体积的水溶液，随后加入相当于该水溶液1/4体积的氯仿，再加入相当于氯仿的1/4体积的正丁醇，将混合物剧烈振荡20～30分钟，然后离心，通过分液漏斗除去水层和溶剂层之间的变性蛋白质，如此重复5次，则可将蛋白质除去。
（2）透析除去小分子物质
将去掉蛋白后的多糖溶液放入透析袋中，将透析袋置自来水中平衡两天，再放入一盛满去离子水的大烧杯中，用磁力搅拌器搅拌杯中水，8个小时后将杯中水换掉，再加入纯净的去离子水继续搅拌8个小时，之后将袋中溶液取出，加入三倍量的无水乙醇沉淀，再依次加入乙醚、甲醇洗涤沉淀，将沉淀冻干（即冷冻干燥）则得到粗品多糖样，亦称为半精品。
2 结果与分析
2.1 山楂叶粗品多糖（KS）的得率及性质
经称量及计算，山楂叶粗品多糖KS的得率为：2.4%。
这里，我们讨论的主要为理化性质：
（1）物理性质
山楂叶多糖粗品KS：为黄褐色固形物，在冷水中膨胀，热水中可溶，水溶液有较高的粘性。
（2）化学性质
①在粗品溶液中加入I-KI，反应为阴性；对菲林试剂的反应也为阴性，这表明该多糖不含淀粉和游离的葡萄糖；
②双缩脲反应呈阴性也表明无蛋白质存在；
③将少量样液滴于滤纸上，用甲苯胺兰染色，呈兰色色斑，表明其粘度较高，且属于多糖范畴。
2.2 粗品多糖的糖含量
这里，检测粗品中糖含量的方法是采用蒽酮－硫酸法，具体操作如下：
配50mg/l标品液，然后如下表操作制备标准曲线：
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如此，可得标准曲线如图1。之后，吸取1ml 样液（0.1mg/ml），如上操作，与标准曲线对照算得相应的数值，并乘以校正系数0.9，即可得山楂叶KS中的糖含量为80%。
[1] 李爱群.山楂的心血管药理作用.湖南中医杂志,1998,4(4):33.
[2]黄沛力.银杏叶、山楂叶对氧自由基的清除作用.中国中药杂志,1996,21(4):245-246.
[3]钟仕强.罗汉果的研究现状.广西农业科学,1992,(4):164-66.
[4]田庚元.植物多糖的研究进展.中国中药杂志,1995,20(7):441-443.
[5]张翼伸.斜顶菌中水溶性多糖的研究.高等学校化学学报, 1983,4(3):364-369.